染色體非整倍體是導(dǎo)致自然流產(chǎn)和體外受精中胚胎移植失敗的主要原因，其發(fā)生率與母體年齡密切相關(guān)。對(duì)有生育需求的高齡女性進(jìn)行PGT-A檢測(cè)，篩選整倍體胚胎移植，能夠有效降低流產(chǎn)率，提高妊娠率和活產(chǎn)率。

極體（Polar body，PB）活檢、卵裂期胚胎活檢以及囊胚期滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢是PGT取材的主要方法。與另外兩種方法相比，極體活檢具有對(duì)胚胎損傷小、倫理上易被接受、胚胎利用率高以及能夠?qū)崿F(xiàn)新鮮胚移植等特點(diǎn)[1]。但既往研究發(fā)現(xiàn)，極體活檢的PGT-A在大多數(shù)臨床環(huán)境中不具有成本效益。隨著納米孔測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，測(cè)序質(zhì)量的顯著提高，基于此的極體PGT-A將會(huì)成為未來(lái)的首選嗎？

 

近期，《Clinical Chemistry》（IF=9.300）和《Journal of Assisted Reproduction and Genetics》（IF=3.100）先后發(fā)表了題為“Evaluation of Nanopore Sequencing on Polar Bodies for Routine Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy”、“Aneuploidy detection in pooled polar bodies using rapid nanopore sequencing”的兩篇文章，深入探討了基于納米孔測(cè)序技術(shù)的極體非整倍體檢測(cè)在臨床中的應(yīng)用價(jià)值，快來(lái)一睹為快吧！

 

PART 01

納入20例患者的102份混合PB樣本，比較基于常規(guī)aCGH以及基于納米孔測(cè)序的PGT-A檢測(cè)結(jié)果[2]。研究設(shè)計(jì)如圖1所示，納米孔測(cè)序工作流程如圖2所示。

圖1：研究設(shè)計(jì)（包括研究中發(fā)現(xiàn)的一致性）。PGT-A：胚胎植入前非整倍體遺傳學(xué)檢測(cè)；aCGH：微陣列比較基因組雜交；PPV：陽(yáng)性預(yù)測(cè)值；NPV：陰性預(yù)測(cè)值。

圖2：納米孔測(cè)序工作流程的示意圖概述，包括嵌入臨床PGT-A工作流程中的各個(gè)操作的時(shí)間測(cè)量。根據(jù)6個(gè)混合樣本的中位測(cè)序時(shí)間計(jì)算每個(gè)樣本的比例測(cè)序時(shí)間。ICSI：卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射；PB1：第一極體；PB2：第二極體：WGA：全基因組擴(kuò)增。

 

納米孔測(cè)序與常規(guī)aCGH分析的比較

共有99個(gè)樣本質(zhì)量合格，被納入分析。
01 共99個(gè)混合PB樣本用于PGT-A檢測(cè)（aCGH與ONT的比較）（圖2）。其中，aCGH檢出整倍體29個(gè)（29.3%），非整倍體70個(gè)（70.7%）。納米孔測(cè)序檢出整倍體32個(gè)和非整倍體67個(gè)，樣本水平一致性為97.0%，靈敏度為0.957，特異性為1.0，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（PPV）為1.0，陰性預(yù)測(cè)值（NPV）為0.906（圖1）。
02 所有aCGH和ONT分析的結(jié)果列在表1中。3例aCGH檢測(cè)為非整倍體的樣本經(jīng)納米孔測(cè)序檢測(cè)為整倍體。
03 在99例樣本中，aCGH分析共檢出195條非整倍體染色體，其中98條為三體，97條為單體，覆蓋23對(duì)染色體。在aCGH和/或ONT中發(fā)現(xiàn)的所有受累染色體如圖3所示。在染色體水平發(fā)現(xiàn)98.7%的一致性（2,273條染色體中的2,243條被一致鑒定為正?；虍惓＃?，敏感度為0.896，特異性為0.995，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為0.940，陰性預(yù)測(cè)值為0.990。
04 通過(guò)納米孔測(cè)序后的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析流水線自動(dòng)生成的整倍體和非整倍體檢測(cè)樣本的實(shí)例染色體分布圖如圖4所示。

圖3：99例混合樣本中整條染色體非整倍體的發(fā)生。TP表示在兩種方法中都被檢測(cè)到為非整倍體的染色體（TP重復(fù)或TP缺失）；FP表示aCGH正常而ONT異常的染色體（FP重復(fù)或FP缺失）；FN表示aCGH異常（FN重復(fù)或FN缺失）而ONT正常的染色體。“真陰性”（兩種方法中的正常染色體）不顯示?？s寫(xiě)：TP，真陽(yáng)性；FN，假陰性；FP，假陽(yáng)性。

圖4：自動(dòng)生成的納米孔測(cè)序工作流程中的染色體分布圖。對(duì)每個(gè)染色體的質(zhì)量值噪聲和MAPD進(jìn)行了映射，并突出顯示了總樣本的閾值（分別為0.6和1.7）?？s寫(xiě)：MAPD：所有兩兩差異絕對(duì)值的中位數(shù)；噪聲，每段內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化閱讀計(jì)數(shù)的中位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

 

表1：ONT與aCGH檢測(cè)結(jié)果比較

 

核酸內(nèi)切酶消化

評(píng)估核酸內(nèi)切酶消化步驟的重要性。雖然高信噪比的樣本顯示出匹配結(jié)果，但額外的消化明顯降低了噪聲，并提高了對(duì)具有挑戰(zhàn)性的案例的CALL出。

 

時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本效益

01 ONT工作流程在1.5h內(nèi)可完成一個(gè)樣本的測(cè)序（從擴(kuò)增的DNA到倍性結(jié)果），大約12小時(shí)內(nèi)可完成12個(gè)樣品的分析，具有更快的處理速度。此外，ONT方法的優(yōu)勢(shì)在于其動(dòng)態(tài)分辨率的調(diào)整能力，這使得它能夠更靈活地生成針對(duì)含有三個(gè)染色體拷貝的極體樣本的詳細(xì)報(bào)告，這是傳統(tǒng)aCGH方法所不具備的。
02 整個(gè)工作流程的材料成本，包括WGA、樣品制備、測(cè)序和數(shù)據(jù)分析，每個(gè)樣品從110美元到240美元（100歐元到220歐元）不等。

 

PART 02

納入102個(gè)混合PB樣本，比較基于常規(guī)aCGH以及基于納米孔測(cè)序的PGT-A檢測(cè)結(jié)果[3]。兩種方法工作流程示意圖，如圖1。

圖1：兩種方法的工作流程示意圖：微陣列比較基因組雜交（aCGH）和牛津納米孔技術(shù)（ONT）。這兩種技術(shù)的初始步驟都是極體活檢和全基因組擴(kuò)增（WGA），然后是特異性文庫(kù)的制備和倍性分類(lèi)和拷貝數(shù)變異（CNV）分析。

圖2：比較兩個(gè)樣本的aCGH和ONT倍性分析。根據(jù)aCGH的平均log2比值閾值進(jìn)行的倍性分類(lèi)，以及報(bào)告的臨床評(píng)估或利用ONT進(jìn)行的計(jì)算機(jī)倍體分類(lèi)。（a）使用aCGH對(duì)CNV狀態(tài)進(jìn)行全基因組分析。（b）使用aCGH檢測(cè)每條染色體的平均log2比值（WGA擴(kuò)增的樣本與對(duì)照DNA）。淺灰色條表示與雄鼠對(duì)照的信號(hào)分布，深灰色條表示與雌鼠對(duì)照的信號(hào)分布。匯集極體的重復(fù)（橙色線表示）和缺失（藍(lán)色線表示）的閾值。（c）使用ONT進(jìn)行全基因組CNV分析。黑點(diǎn)表示大約1 Mb的每個(gè)可變寬度bin的總讀計(jì)數(shù)。黃色線表示重復(fù)，紫色線表示缺失。（d）使用ONT繪制每條染色體的裝箱讀片計(jì)數(shù)箱線圖。彩色線顯示預(yù)期讀取計(jì)數(shù)。黃色線表示重復(fù)的預(yù)期讀取計(jì)數(shù)，紫色線表示缺失的預(yù)期讀取計(jì)數(shù)。

 

 

非整倍體檢測(cè)—ONT vs. aCGH

01 整個(gè)基因組的信號(hào)模式在視覺(jué)上相似，每條染色體的平均值也相近（圖2）。
02 96%（98/102）的樣本的倍性檢測(cè)結(jié)果（整倍體、非整倍體）一致。4個(gè)不一致樣本（ID023、ID028、ID062、ID072），aCGH歸類(lèi)為整倍體，而ONT歸類(lèi)為非整倍體（表1）。而最終臨床評(píng)估顯示，只有兩個(gè)樣本（ID023和ID062）的結(jié)果與ONT不同，另外兩個(gè)樣本（ID006和ID063）的臨床評(píng)估為不確定。

表1：兩種方法倍性分類(lèi)的樣本數(shù)交叉表

（藍(lán)色：一致；紅色：不一致）

每條染色體的非整倍性統(tǒng)計(jì)

01 基于aCGH分析的2,346條染色體中，92.5%（2,169/2,346）的染色體倍性分類(lèi)結(jié)果與ONT一致。aCGH檢測(cè)的94.0%（47/50）染色單體重復(fù)、93.7%（2,032/21,68）整倍體和70.3%（90/128）的染色單體缺失與ONT分類(lèi)的結(jié)果一致（表2）。
02 少數(shù)樣本染色體倍性分類(lèi)不一致率高。大多數(shù)樣本中ONT數(shù)據(jù)的基線與aCGH數(shù)據(jù)處于不同的水平。例如，對(duì)于樣本ID016，將ONT基線與aCGH基線相比較，使差異從17條染色體減少到僅1條染色體（圖3b，d，f）。因此，排除了超過(guò)一半染色體為非整倍體的8個(gè)樣本，使用ONT進(jìn)行進(jìn)一步的一致性分析。除了上述8個(gè)樣本，每條染色體的一致性增加到97.7%（2113/2162）（表3）。
03 總體而言，使用ONT的非整倍體染色體數(shù)目高于aCGH（150 vs. 131）。在兩種方法中，染色單體缺失的總數(shù)（ONT：84，aCGH：83）均高于染色單體重復(fù)的總數(shù)（ONT：66，aCGH：48）（圖4）

 

表2：兩種方法用于特定倍性分類(lèi)的染色體數(shù)目交叉表（藍(lán)色：一致；紅色：不一致）

 

表3：過(guò)濾高度復(fù)雜樣本后，兩種方法用于特定倍性分類(lèi)的染色體數(shù)目交叉表（藍(lán)色：一致；紅色：不一致）

 

部分重復(fù)和缺失

01 ONT工作流程可自動(dòng)識(shí)別樣本ID050的2號(hào)染色體的50 Mb重復(fù)，樣本ID005的1號(hào)染色體約13 Mb的缺失，樣本ID072的2p重復(fù)、7p缺失和Xq重復(fù)等微小畸變。通過(guò)可視化回顧全基因組分析結(jié)果，可以在aCGH數(shù)據(jù)中看到這些畸變（圖3a、c、e）。

圖3：片段性非整倍體檢測(cè)（ID005）和基線偏移（ID016）。對(duì)于a-d和f，上述給出了使用ONT計(jì)算的倍性分類(lèi)，或者基于aCGH的平均log2比值閾值進(jìn)行的倍性分類(lèi)，這與報(bào)道的臨床評(píng)估一致。a,b.使用aCGH對(duì)兩個(gè)樣本的CNV狀態(tài)進(jìn)行全基因組分析。c,d. 利用ONT進(jìn)行全基因組CNV分析。黑點(diǎn)表示大約1 Mb的每個(gè)可變寬度bin的總讀計(jì)數(shù)。黃色線表示重復(fù)，紫色線分別表示缺失或雙倍缺失。e.上述CNV分析的單染色體視圖（樣本ID005）顯示1號(hào)染色體的部分缺失。f. 使用ONT進(jìn)行全基因組CNV分析，樣本ID016的數(shù)據(jù)集減少到300 k reads

 

圖4：每種方法的染色體重復(fù)和缺失的絕對(duì)數(shù)量，包括94個(gè)樣本（高度復(fù)雜的樣本被過(guò)濾）

 

所需的讀取次數(shù)和工作流程時(shí)間

01 aCGH的工作流程大約需要24小時(shí)，包括16小時(shí)的過(guò)夜雜交步驟。ONT的工作流程可以在相似的時(shí)間內(nèi)對(duì)大約1 M的讀數(shù)進(jìn)行測(cè)序和分析。如果計(jì)劃進(jìn)行新鮮胚胎移植，工作流程時(shí)間很重要。為了模擬更短的測(cè)序時(shí)間，將reads的數(shù)量隨機(jī)降采樣到300 k，實(shí)現(xiàn)了大約5 h的測(cè)序時(shí)間（圖1）
02 在分析縮減后的數(shù)據(jù)集后，相對(duì)于原始ONT結(jié)果，每個(gè)樣本的倍性分類(lèi)結(jié)果相等，只有兩個(gè)樣本的21號(hào)染色體缺失小于染色體長(zhǎng)度的一半，因此預(yù)測(cè)不為缺失，而在另一個(gè)樣本中，與原始結(jié)果和aCGH評(píng)估不同，使用縮減后的數(shù)據(jù)集將倍性分類(lèi)分配為非整倍體。

 

總   結(jié)

• 與aCGH相比，納米孔測(cè)序具有更多的優(yōu)勢(shì)，包括（但不限于）檢測(cè)快速、測(cè)序價(jià)格低廉以及所需的初始投資成本。

• ONT方法在檢測(cè)極體的染色體倍性和微重復(fù)或缺失方面展現(xiàn)了明顯優(yōu)勢(shì)，特別是在考慮到匯集的極體中存在三個(gè)染色體的情況下。

• 相較于標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)aCGH方法，ONT技術(shù)能夠更準(zhǔn)確、高效地評(píng)估染色體狀態(tài)，為PGT-A提供了一種新的、更優(yōu)的檢測(cè)方案。

 

參考文獻(xiàn)

[1] 陳佳, 伍瓊芳. 極體活檢在胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)中的臨床應(yīng)用價(jià)值[J].中華生殖與避孕雜志, 2022, 42(11):6.DOI:10.3760/cma.j.cn101441-20220831-00374.

[2] Oberle, A., Hanzer, F., Kokocinski, F., Ennemoser, A., Carli, L., Vaccari, E., Hengstschläger, M., & Feichtinger, M. (2024). Evaluation of Nanopore Sequencing on Polar Bodies for Routine Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy. Clinical chemistry, hvae024. Advance online publication. https://doi.org/10.1093/clinchem/hvae024

[3] Madritsch, S., Arnold, V., Haider, M., Bosenge, J., Pfeifer, M., Weil, B., Zechmeister, M., Hengstschläger, M., Neesen, J., & Laccone, F. (2024). Aneuploidy detection in pooled polar bodies using rapid nanopore sequencing. Journal of assisted reproduction and genetics, 10.1007/s10815-024-03108-7. Advance online publication. https://doi.org/10.1007/s10815-024-03108-7